白腐真菌酶系具有獨特的降解機理,對包括木質素、多環芳烴、氯代芳烴、染料、炸藥、農藥等多種難降解有機污染物有很強的降解能力[ 1, 2 ] ,這種特殊的降解機制展現了巨大的潛在應用前景,引起了學術界和工業界的極大興趣[ 3 ] 。自從Tien等[ 4 ]和Glenn 等[ 5 ] 同時發現白腐真菌黃孢原毛平革菌( Phanerochaete chrysosporium )對木質素降解的關鍵是其產生的胞外過氧化物酶系的作用后,人們對該菌比較重要的3 種酶即木質素過氧化物酶( ligninperoxidase,簡稱L iP) ,錳過氧化物酶(Mn2dependentperoxidase,簡稱MnP)和漆酶(Laccase)進行了廣泛研究。黃孢原毛平革菌對異生物質的降解主要依賴于由該菌細胞分泌的胞外酶進行,需氧并啟動一系列的自由基鏈反應,實現對底物的無特異性的氧化分解[ 6 ] 。細胞外的非專一性的降解體系,使污染物不必進入細胞,從而使該菌對不溶的、有毒的、結構各異的物質均有作用能力。另一方面,這種關鍵酶胞外工作的特點要求除了必須滿足菌體需要的營養限制(限碳或限氮) 、足夠的供氧等環境條件外,還要避免其胞外酶的結構及活性遭受剪切力等因素的破壞。因此,所用反應器的結構和運行參數對其產酶至關重要。本文就白腐真菌的培養方式與條件、反應器的選擇等方面較為系統地闡述了反應器對其產酶的影響。

　　1木質素降解酶系的酶活性定義及測定方法

　　1. 1　酶活性定義

　　酶是生物催化劑,所以酶活性(也稱酶活力)的大小常用它催化某一種特定反應的能力來表示。酶活性的大小,也就是酶量的多少,用酶的活力單位( active unit,簡稱U)來度量。1961年國際生物化學學會( IUB)酶學會議規定: 1個酶活力單位,是指在特定條件下,在1 min內能轉化1μmol底物的酶量,或是轉化底物中1μmol的有關基團的酶量。酶的比活性( specific activity)也稱為比活力,是指每毫克蛋白所具有的酶活力單位數。比活力是表示酶制劑純度的一個重要指標。對同一種酶來說,酶的比活力越高,純度越高。

　　1. 2　測定方法

　　木質素降解酶系的酶活性測定常用分光光度法,此方法不需要昂貴的儀器,操作簡便快捷,對實驗條件的要求也不是太高,因此應用較為普遍。酶標儀原理與分光光度計相同,但它可同時測定多個樣品并實現了進樣讀數的自動化,特別是與計算機聯用后,使酶活性的測定過程更為簡單快捷,準確可靠。在緩沖環境下,L iP活性測定體系中,以藜蘆醇為底物;MnP活力測定體系中,常以Mn2 +為底物,添加H2O2 啟動反應; Laccase活力測定體系中,常以ABTS為底物,測定酶對其的氧化速度。

　　2　培養方式與條件

　　2. 1　培養方式

　　在白腐真菌產酶的培養方式上,研究最多的是液體培養,采用振蕩培養的情況比靜置培養的多,采用深層培養比淺層培養的多。近年來固體培養的報道越來越多。付時雨等[ 7 ]發現:固體培養條件下貝殼狀革耳菌產生的漆酶活性遠大于它在液體培養條件下產生的酶活性,而且對同功酶的產生有較大的影響。固態培養具有操作簡便、成本低廉、產酶率高、耗能低等優點,更重要的是它的產酶條件更接近于自然條件下白腐真菌的生長狀態,更適于工業化大規模產酶。Couto等[ 8 ]研究了在固態條件下培養白腐真菌連續操作產酶時發現:該操作有效避免了菌絲的過度生長、菌絲周圍多糖和使酶失活物質如蛋白酶等的生成等。MnP酶活性在第11 d達到峰值180 U /L,平均酶活性為75 U /L;而LiP酶活性同樣在第11 d達到峰值313 U /L,平均值為Carvalhoc等[ 9 ]在填充床中以半連續操作方式獲得酶活的11倍。

　　2. 2　營養條件

　　常用的培養基主要包含碳氮源、緩沖液、微量元素、生長因子等。因黃孢原毛平革菌的降解功能主要發生在次級代謝階段,與降解有關的酶只有當一些主要營養物(如氮、碳)受到限制時才能合成。營養限制使黃孢原毛平革菌應答產生了對底物的降解酶系統。李越中等[ 10 ]發現:糊精是最優碳源,混合糖源比單獨糖源好。在氮源中,酵母浸汁和牛肉膏培養物中木質素過氧化物酶活性最高,低碳高氮培養基有利于酶的合成。 Dosoretz等[ 11 ]考察了通氧和通空氣對2種過氧化物酶合成的影響,發現空氣條件下菌絲不合成木質素過氧化物酶,能合成錳過氧化物酶但低于通氧時產生的酶活性。而柯世省等 [ 12 ]的研究結果表明,空氣環境下限碳培養黃孢原毛平革菌,合成的木質素過氧化物酶最高酶活性可達360 U /L,比通純氧條件下限碳培養時的木質素過氧化物酶活性要高160%。這可能是由于過量地通氧增加了葡萄糖的消耗,產生較多的蛋白酶和多糖,從而抑制了酶活性,酶活性越過峰值后下降也越快。由此可見,在提高酶活性方面,有些結果是看似相互矛盾,需要具體情況具體分析。Dosoretz等[ 11 ]的研究結果表明:在限氮培養時生長階段和次級代謝階段分別生成初級蛋白酶和次級蛋白酶,它們對木質素過氧化物酶有破壞作用。為提高合成酶的能力,可以采用流加葡萄糖或加入蛋白酶抑制劑來減小這種作用。在限碳培養條件下, Kirk等[ 13 ]發現緩沖液以鄰苯二甲酸對產酶最有利,培養的最佳pH是415。Fenn 等[ 14 ] 認為二甲基琥珀酸緩沖液(DMS)是較好的緩沖液, DMS是目前最常用的緩沖液。Kirk等[ 13 ]研究了添加藜蘆醇和微量元素對合成木質素過氧化物酶的影響,發現添加一定量的這兩種成分,不僅顯著提高了酶活性,而且酶活性的總量也有增加。他們還證明了維生素B1 是菌絲生長和產生木質素降解酶系所必需的唯一維生素。Jager等[ 15 ]報道在靜置培養中黃孢原毛平革菌可以合成木質素過氧化物酶,但在搖瓶培養中只有加入吐溫等表面活性劑才能合成,并且通過添加表面活性劑span280 (0. 05% )成功地解除了振蕩培養對產酶的抑制(轉速為200 r/min) ,從而為生物反應器的研究開辟了道路。吐溫80的最佳濃度是0. 05% ～0. 1% ,此濃度下它不僅增加了細胞膜的通透性,解除了已合成的酶在胞內的積累所產生的抑制作用,而且還有一定的生理作用。Asther等[ 16 ]研究了溫度對木質素過氧化物酶合成的影響時發現:一般來說對數生長結束后降低溫度有利于次級代謝物的啟動,因此為提高產酶量可以把培養溫度分為2個階段來控制:第一階段是生長階段,第二階段是木質素過氧化物酶系合成階段?？刂粕L溫度為37 ℃、酶合成期溫度為30 ℃培養所得的最高酶活與溫度恒定在37 ℃培養相比,要高1倍多。綜上所述,白腐真菌產酶的培養方式多為液體培養,常采用限碳或限氮培養基,加入維生素和表面活性劑,通入空氣或氧氣等措施來強化產酶。然而即使同一菌種,在不同反應器中的最佳產酶條件也不盡相同。目前的研究也都還集中在實驗室的中小型反應器階段,這些都為白腐真菌酶系的大規模生產及應用帶來一定困難。

　　3　細胞的生長方式

　　近年來,采用固定化細胞培養合成木質素降解酶系已經引起了廣泛的重視,和游離細胞培養相比,它能更有效地合成木質素降解酶系。至今,已報道過多種載體對黃孢原毛平革菌的固定,其中用尼龍網、聚丙烯、燒結玻璃、多孔陶瓷、不銹鋼、硅管、瓊脂糖、瓊膠顆粒和聚(苯乙烯2二乙烯基苯)均取得了較好的效果。菌絲固定化后,穩定性增強并且可以很方便地重復利用來合成木質素降解酶。很可能是不與流體直接接觸的內層菌體免受剪切力的影響,酶的高級結構和活性中心不易被破壞,也就提高了酶活性。張朝暉[ 17 ]對限氮培養基在純氧環境下培養黃孢原毛平革菌合成木質素過氧化物酶的條件進行了研究,在搖瓶培養中,較大的菌絲球和較小的通氧強度將延遲酶的合成。在 175 r/min的轉速下,用聚氨酯泡沫固定化培養,木質素過氧化物酶的最高酶活性比游離菌絲球培養時提高1倍。Ruckenstein等[ 18 ]用多孔聚合物固定黃孢原毛平革菌,在限碳時培養合成木質素過氧化物酶(聚合顆粒形狀為邊長0. 4 cm的立方狀,比表面積224 m2 /g)時發現,培養至第6 d得到最大酶活性為602 U /L,比游離培養所得酶活性( 307 U /L)高1倍,并且達到最大酶活性時間也比游離培養提前了8 d。固定化顆粒6周內重復使用了16批,最高酶活性737 U /L,第16批的酶活仍達到594 U /L。L inko[ 19 ]在8 L 的發酵罐中用聚氨酯泡沫固定黃孢原毛平革菌,產酶期通55%～70%的氧氣,最高酶活性可達550 U /L。為了更好地與空氣接觸, Feijoo等[ 20 ]設計聚氨酯泡沫塊半懸浮、半浸沒在培養基中進行搖瓶培養,在限碳條件下,最高酶活為300 U /L。上述培養,聚氨酯泡沫的用量都很大( 20 g/L 培養基) 。Kirkpatrick等[ 21 ]用少量的聚氨酯泡沫來固定,最高酶活只有100 U /L。Nakamura等[ 22 ]以聚氨酯泡沫為載體固定菌體,在限氮條件下合成木質素降解酶系, L iP、MnP和Lac2case的酶活峰值分別高達450 000、370 000 和100 000 U /L。由此可見,通過適當載體對菌體進行固定,可顯著提高產酶效率。

　　4　不同反應器的特點及應用

　　反應器的構型設計和參數確定是關鍵,也是國內外研究的熱點。合成酶所用的生物反應器應該滿足如下基本要求:反應器內流體混和均勻、剪切力適宜;為了給細胞生長和目標產物酶的合成提供最佳的環境條件,需要能夠對反應器中的pH、溫度、溶解氧、氧化還原勢、攪拌轉速等參數進行測量和控制;必須防止雜菌污染,維持純種培養等[ 23 ] 。

　　4. 1　機械攪拌式反應器

　　機械攪拌式反應器是最常用的反應器,它能適用于大多數的生物培養過程,已經形成標準化的通用設備。只有在它的氣2液傳遞性質或剪切力不能滿足生物過程時才會考慮選用其他類型的反應器[ 24 ] 。為了防止攪拌時液體產生渦流,可在反應器內側安裝擋板, 以增強液體的徑向混合。L inko等[ 19 ]在10 L的發酵罐中,把黃孢原毛平革菌固定在尼龍網上,以限碳培養方式合成木質素過氧化物酶。為提高產量,根據富氧環境對產酶有利的特點,他們在生長期通空氣,而在產酶期通純氧(氧分壓維持在50%～70%) 。第3 d出現酶活性后,多次加入l g/L的葡萄糖刺激酶活性的增加,最高酶活性為730 U /L。Venkatadri等[ 25 ]在普通的發酵罐中插入纏繞著聚硅氧塑料管的不銹鋼管,在管內通氧給生長在塑料管表面的菌絲供氧,最高酶活性達到203 U /L,可連續重復產酶5周以上。Couto等[ 8 ]在發酵罐中實現了固體培養,他們采用間歇式操作時,L iP酶活性均值高達24618 U /L, Laccase 均值為6815 U /L;當進行30 d的連續培養時,MnP酶活性均值為150 U /L, Laccase 酶活性均值可高達330U /L。

　　4. 2　固定床

　　固定床反應器的基本原理是反應液連續流動通過靜止不動的固定化菌體(或生物催化劑) 。固定化的主要優點是可以重復利用菌體細胞,便于將菌體細胞與反應產物分離[ 26, 27 ] 。Shim等[ 28 ]把生長培養基和誘導培養基交替通入到8 L的固定床反應器中,間歇培養合成木質素過氧化物酶,最高酶活性為8100 U /L。Mielgo等[ 29 ]以2, 62二甲氧基苯酚為底物,在固定床生物反應器中半固體培養黃孢原毛平革菌,最大MnP酶活性達1293 U /L, L iP酶活性最大為225 U /L。Couto等[ 30 ]在填充有尼龍海綿的管式固定床反應器中,以半固態條件操作進行了2批培養,第一批中,葡萄糖消耗速率為0157 g/L·d,氨氮在第4 d消耗完,MnP在第3 d開始出現,酶活性為76 U /L,第7 d達到峰值為1293 U /L; LiP在第2 d開始出現,酶活性16 U /L,第8 d達到峰值為225 U /L;而Laccase的合成不規則,最大值為33 U /L。在第二批操作中,葡萄糖的消耗速率為0133 g/L·d,此時MnP在第2 d出現為45 U /L,第6 d達到峰值956 U /L,比第一批低了35%;而LiP在第2 d出現為20 U /L,第5 d達到峰值165 U /L,比第一批略微下降; Laccase更不規則,峰值達到58 U /L。這也說明了營養調控的重要性。固定床反應器常用于連續生產,反應器可連續運行20多d, Feijoo等[ 31 ]認為平推流和完全混合都不利于固定床產酶,產酶的最佳回流比是2∶1。

　　4. 3　滴流床

　　填充床適合于固定化微生物細胞連續產酶過程。一般從上端流出含較高濃度產品的反應液,這種情況下,單位體積反應器內固定化顆粒的裝置量比流化床大得多。但由于固定化細胞長期靜止地堆積在一起,隨著細胞的不斷生長,容易造成營養供應不良。對于好氧發酵,也可以有限度地向填充床通氣,這時一般稱為滴流床。但由于固定化細胞裝填過密以及必須避免產生流化,通氣量受到嚴格的限制[ 32 ] 。Ruggeri等[ 33 ]利用滴流床生物反應器間歇培養黃孢原毛平革菌,反應器內散堆鞍形填料(填料表面經處理形成一層海藻酸鈣薄膜) ,膜內固定菌體,培養基循環利用,在第10 d木素過氧化物酶活性達1220 U /L。

　　4. 4　轉鼓式反應器

　　轉鼓式生物反應器通常是通過轉盤或轉鼓的旋轉達到混合的目的,其混合程度一般,取決于發酵的要求。通常是用較低的旋轉速度(1～15 r /min) ,高速旋轉混合的應用很少。原因是高旋轉速度會損傷菌絲體,而且能過多的產生熱量,影響微生物產酶和其他次級代謝產物。轉鼓式反應器的轉鼓直徑不宜過長、體積不宜過大,否則不僅操作困難,而且在旋轉過程中會導致培養基結成球狀,從而影響微生物對營養物的利用。除機械攪拌式反應器以外的其他類型反應器中,轉盤反應器最早合成木質素降解酶:在2. 5 L的反應器中(轉速為1 r/min) ,得到最大木質素過氧化物酶活性為30 U /L[ 34 ] 。Dominguez等[ 35 ]采用轉鼓式生物反應器半浸沒培養黃孢原毛平革菌,以尼龍海綿為載體,菌絲固定在尼龍海綿體上,采用間歇式培養, 通氣量分別為0. 5 L /L· min (升通氣量/升培養基·分鐘)和1 L /L · min時進行試驗。結果表明:在通氣量為1 L /L· min時酶活性是015L /L·min時的3倍,MnP在第11 d峰值達1350 U/L,LiP在第6 d峰值達364 U /L。而且在此操作下還出現了Laccase,在第3 d出現峰值為56 U /L。

　　4. 5　鼓泡塔

　　鼓泡塔的主體是一個容器,通常呈圓柱形,高度和直徑之比通常為4～6。在容器底部通過多孔管、多孔盤、燒結玻璃、燒結金屬或者微孔噴霧器向反應液通氣。為了加強混合,還可以在容器內安裝一系列水平的多孔板、垂直的隔板等。鼓泡塔的優點是不需要機械傳動設備、動力消耗小、不易污染菌種;缺點是不能提供足夠高的剪切力,傳質效率低,絲狀菌有時會形成很大的菌絲團而影響代謝和產物合成。張朝暉等[ 36 ]以聚氨酯泡沫塑料為固定化載體,在三相鼓泡塔反應器中培養黃孢原毛平革菌,可以高效地合成木質素降解酶系。實驗表明,合成木質素過氧化物酶和錳過氧化物酶的最佳通氣量均是1. 0 L /L· min。在此通氣量下,最大木質素過氧化物酶的酶活性達367 U /L,最大錳過氧化物酶的酶活性達4720 U /L。在培養基相同和單位體積載體用量相同的條件下,與搖瓶培養相比,酶活性分別增大1倍和1. 2倍。這是因為在搖瓶培養中,氣液間的傳質只在液相表面進行,而在三相鼓泡塔中,通過分布器進入液相主體的氣體已經分散成許多微小的氣泡,大大增加了氣液相界面積,強化了傳質,氣泡間的擾動也大大促進了三相間的物質傳遞,培養液所受的剪切力比搖瓶小得多。一定條件下,在三相鼓泡塔中可以進行重復間歇培養生產木質素過氧化物酶,連續進行了5批培養,每批木質素過氧化物酶的最大酶活性均在250 U /L以上,最高酶活性出現在第二批為480 U /L,總培養時間達22 d。

　　4. 6　氣升式反應器

　　氣升式反應器是應用最為廣泛的生物反應器,是在鼓泡塔的基礎上發展起來的。它利用空氣的噴射功能和流體密度差造成反應液循環流動,來實現液體的攪拌、混合和氧傳遞。即不用機械攪拌(避免了菌絲的纏繞附著) ,完全依靠氣體的帶升使液體產生循環發生湍動,從而達到氣液混合和傳遞的目的[ 37 ] 。它的容器被一個隔板或導流管分割成相通的2個區域,其中只有一個區域通氣。通氣的區域稱為上行區,不通氣的區域為下行區。由于上行區的氣泡向上流動,帶動著液體從下往上運動,并在頂部與氣體分離后再沿下行區往下,如此循環往復。有時上行區和下行區可以分別是一個容器,兩者通過底部和頂部的管道相連,這樣的氣升式反應器稱為外循環的氣升式反應器。與攪拌罐相比,氣升式反應器增加了促進流體循環的裝置,從而大大改善了相間混合與接觸條件,有利于傳質和反應過程,具有結構簡單(內部沒有運動部件) 。不需攪拌、節省能量、氧傳質效率高、不易污染、剪切力小、安裝維修方便等優點,特別適合于對剪切力敏感的微生物細胞[ 38 ] 。Bonnarme等[ 39 ]在7 L (工作體積為5 L)的氣升式反應器中實現了L iP和MnP的分別培養,在培養液中Mn ( II)較低濃度515 ×10- 9mol/L 時,可以合成LiP,而在培養液中Mn ( II)濃度高達212 ×10- 7mol/L時則合成MnP。在開始的12 h內,氣體的體積流量對影響菌絲球的形狀至為關鍵。體積流量0126～0128 L /L時效果最佳:太高時導致過量泡沫,太低會形成一些大的菌絲團塊而不利于傳質傳氧,并且酶的合成量很少。培養50 h后MnP的酶活性在低錳條件下出現,但從未超過130 U /L。L iP的酶活性在培養70 h后出現,并且穩步上升至140h的760 U /L。MnP在高錳條件下培養50 h時出現(此時LiP未被檢測到) ,其酶活性增至94 h時的950 U /L。由此可見,Mn ( II)可以有效地調節L iP和MnP的合成。Gerin等[ 40 ]比較了由氣體攪動的氣升式反應器、鼓泡式反應器和有螺旋槳攪動的攪拌式反應器后發現,氣體攪動比機械攪動更有利木質素降解酶的合成,氣升式反應器。鼓泡式反應器中LiP酶活性的最大值分別達4500 U /L、3140 U /L,MnP酶活性最大值分別達1944 U /L、1146 U /L,而攪拌式反應器中LiP酶活性僅為516 U /L,MnP酶活性最大值僅為618 U /L。這是因為機械攪動影響了木質素降解酶的分泌和穩定。綜上所述,盡管各種反應器都有其自身優點,但因氣升式反應器結構簡單、氧傳質效率高、剪切力小等優點,也就更適合白腐真菌產酶效率的提高[ 41 ] 。

　　5　結　語

　　白腐真菌酶系對底物有很強的非特異性氧化能力,因此具有廣泛的用途[ 42, 43 ] 。但白腐真菌酶系在自然界中的產率很低。目前國內外就如何優化反應器提高其產酶效率的研究尚無定論,反應器的設計不僅要考慮傳質傳氧、檢測調控、運行維修等反應器自身的一般特性[ 44, 45 ] ,還要考慮菌體好氧產酶以及酶易受剪切力破壞等特殊要求[ 46 ] 。因此更深入系統地對反應器進行實驗研究,掌握各種反應器的動力學參數和反應器模型才能使之設計更趨完善。酶應用的前提條件是大規模發酵獲得酶,然而目前尚沒有大規模發酵木質素降解酶的報道。因此如果能把反應器放大,使白腐真菌酶系得以大規模工業化生產應用,則必將有廣闊的應用前景[ 47, 48 ] 。

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